Các đơn vị Lục quân Đế quốc Nhật Bản đầu tiên được trang bị kiểu máy bay này là các trung đoàn bay (sentai) số 5, 59, 200, 244 và đại đội bay độc lập 81. Cùng thời gian này, Lục quân yêu cầu phát triển một phiên bản mới cải tiên đôi chút được gọi là Ki-100 I-Otsu hay Máy bay Tiêm kích Lục quân Loại 5 Kiểu 1b. Kiểu này có một nóc buồng lái dạng bọt nước để cải thiện tầm nhìn và khung máy bay nhằm mục đích mang một động cơ bố trí hình tròn. Khi việc cung cấp những khung máy bay Ki-61-II rỗng kết thúc, phiên bản mới được đưa vào sản xuất. Cùng với các đơn vị Lục quân kể trên, các trung đoàn bay 17, 18, 25, 111 và 125 cũng được huấn luyện để sử dụng kiểu máy bay này.

Chiếc Ki-100 bắt đầu tham gia chiến đấu vào ngày 9 tháng 3 năm 1945 và chịu đựng tổn thất đầu tiên vào tháng 4 năm 1945, tuy nhiên lực lượng Đồng Minh nhanh chóng đánh giá chiếc máy bay tiêm kích mới là một kiểu máy bay chiến đấu hàng đầu[3]. Chỉ có một số ít máy bay Ki-100 sẵn có so với số lượng những chiếc Ki-84 nhưng chúng được nhanh chóng bố trí đến các trung đoàn bay 4, 5, 17, 20, 59, 111, 112 và 244 (việc bố trí này đã trải rộng đáng kể số máy bay ít ỏi có được, nhưng nhiều trong số các đơn vị này chỉ được tái trang bị một phần). Đến năm 1945, Ki-100 được nhìn nhận là một máy bay tiêm kích quan trọng trong lực lượng. Tuy nhiên trong việc đánh chặn những chiếc máy bay ném bom B-29 trên tầm cao (tại một thời điểm trong cuộc chiến, những cuộc tấn công của B-29 diễn ra ở tầm thấp), chiếc máy bay tiêm kích mới gặp khó khăn do kiểu động cơ Ha-112-H bị suy giảm động lực ở độ cao lớn. Cách tấn công những chiếc Superfortress hiệu quả nhất là tấn công trực diện cực kỳ nguy hiểm, chỉ thay đổi đường bay khi đến gần những chiếc máy bay ném bom. Một sai sót trong nỗ lực này là rất nguy hiểm, vì sự tập trung hỏa lực phòng thủ từ chiếc máy bay ném bom. Trong kiểu chiến đấu này, những chiếc máy bay tiêm kích đánh chặn Mitsubishi J2M Raiden của Hải quân là vượt trội hơn cả.[4]

Vào ngày 25 tháng 7 năm 1945, 18 chiếc máy bay tiêm kích Ki-100 thuộc Trung đoàn bay 244 nghênh chiến cùng mười chiếc F6F Hellcat thuộc Phi đoàn Belleau Wood trong một trận không chiến đáng ghi nhớ, khi các phi công Ki-100 báo cáo đã bắn rơi đến 12 máy bay địch và bị tổn thất hai chiếc. Nhiều tranh luận từ cả hai phía nổ ra chung quanh con số chiến thắng và tổn thất thực sự của trận này, nhưng điều này cho thấy chiếc Ki-100 đã trở thành một vũ khí đối địch lợi hại. Tổn thất thực sự của trận này là hai chiếc Hellcat cùng hai chiếc Ki-100 bị mất; trong đó một chiếc Ki-100 và một chiếc F6F bị rơi do va chạm giữa Thiếu tá Tsutae Obara và Thiếu úy Edwin White và cả hai đều bị thiệt mạng.[5] Ki-100 được đánh giá cao về tính nhanh nhẹn của nó, và một chiếc Ki-100 được điều khiển thành thạo có thể vượt qua mọi chiếc máy bay tiêm kích hàng đầu của Mỹ kể cả những chiếc P-51D Mustang và P-47N Thunderbolt chắc chắn theo hộ tống các cuộc ném bom của B-29 xuống Nhật Bản vào lúc đó, và sánh được về tốc độ đặc biệt là ở độ cao trung bình. Trong tay một phi công kinh nghiệm, chiếc Ki-100 là một đối thủ nguy hiểm, và cùng với chiếc Ki-84 của Lục quân và chiếc Kawanishi N1K-J của Hải quân, là những chiếc máy bay tiêm kích Nhật Bản duy nhất có thể đối chọi được những kiểu máy bay Đồng Minh mới nhất.[6]

Sau trận ném bom nhà máy Kagamigahara và sự chậm trễ trong việc giao hàng từ các nhà máy vệ tinh, tốc độ sản xuất của chiếc Ki-100 ngày càng giảm sút, và trong khoảng thời gian giữa tháng 5 và tháng 7, chỉ có 12 chiếc được giao hàng. Cuối cùng, việc sản xuất phải chấm dứt do bị ném bom, và chỉ có tổng cộng 118 chiếc thuộc phiên bản Kiểu 1b được giao hàng. Tổn thất cuối cùng của chiếc Ki-100 trong cuộc chiến diễn ra vào ngày 14 tháng 8 năm 1945, chỉ một ngày trước khi Nhật Bản đầu hàng, khi Trung sĩ Tamagake bị một chiếc Mustang bắn rơi.